The isolation and characterisation of a Psittacine Adenovirus from infected parrots in South Africa
Loading...
Date
2007-11
Authors
Mfenyana, Nandipha
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: Incidences of an Adenoviral infection have been recently reported in South African psittacine birds. These birds have been diagnosed by histopathology post-mortem. This Psittacine Adenovirus (PsAdV) has been reported as the second most deadly disease-causing virus in psittacine species with Psittacine Beak and Feather Disease Virus (PBFD) being the first. High mortalities with no symptoms have been observed amongst the birds. There is limited information on the distribution and antigenic characterisation of PsAdV in South Africa. This prompted the investigation into the isolation and characterisation of this PsAdV by virtue of molecular and conventional techniques. Two birds suspected of being exposed to PsAdV were donated to the laboratory. Histopathological tests were already performed on these birds by a consulting veterinarian who found evidence supporting the Adenoviral infection. The livers of the parrots received were homogenised and DNA was then extracted from the suspension. These birds were from the same parrot breeding farm in the Free State region and their deaths occurred around September a year apart, inferring a seasonal occurrence of the infected birds. A polymerase chain reaction (PCR) was established as a rapid test to confirm the Adenoviral infection amongst the birds received. A primer pair amplifying the hexon gene loop1 variable region (L1) located in two conserved pedestral regions was modified using an existing primer pair as this gene codes for the hexon protein where the group, subgroup and type specific antigenic determinants are located. PCR resulted in the expected amplicon size of ~587bp for all the samples tested with the use of a Fowl Adenovirus (FAdV) received from the Faculty of Veterinary Science, Onderstepoort (Pretoria) as a positive control. The positive DNA products were then subjected to restriction fragment length polymorphism (RFLP) in order to investigate differences in the restriction profiles. The suspected PsAdV samples provided a similar profile compared to the different one elicited by the fowl sample where only two bands were similar to the other profile with two extra unique bands observed. These samples were then ligated into the pGem-Teasy vector and the positive clones were selected and sent to Inqaba Biotech for sequencing. The results where blasted on the NCBI GenBank Database and a high degree of similarity was found with the PsAdV sequences already on the database. Both the nucleotide and amino acid sequence alignments performed using DNAssist v2.2 showed a high homology with all the sequences. There were some differences observed and with the protein alignment the different amino acids observed were of the same group of amino acids. This suggested that the sequences were of the same genogroup. A neighbour-joining phylogenetic tree was constructed and this showed 4 major clusters where one of them represented the PsAdV sequences. The PsAdV sequences were separated from the other clusters by a 100% bootstrap value. The two minor branches within this cluster separating the UFS sequences from the reference PsAdV sequences suggested that the UFS samples could be different isolates. Attempts to cultivate the virus in primary chicken embryonated liver cells and SPF embryonated eggs were successful and a cytopathic effect (CPE) typical of Adenoviruses was seen in the cells. With the SPF eggs definite differences were observed between the infected embryos and the negative control embryos. These were also typical of Adenoviruses, particularly of group I Aviadenoviruses (AAVs). We propose that further studies be concentrated on the development of antibodies against this PsAdV in order to establish serological techniques so to be able to differentiate between different serogroups and isolates. We also propose the development of a vaccine against this psittacine Adenovirus so to put biosecurity measures in place.
Afrikaans: Gevalle van Adenovirale infeksies is onlangs in Suid-Afrikaanse psittacine voëls aangemeld. Diagnose van die voëls was gedoen deur na-doodse histologiese ondersoeke. Die Psittacine Adenovirus (PsAdV) word beskou as die tweede mees dodlikste virus in psittacine spesies met Psittacine Beak and Feather Disease virus (PBFD) die dodlikste. Daar is tans beperkte inligting beskikbaar ten opsigte van die verspreiding en die antigeniese karakterisering van die PsAdV in Suid-Afrika. Dit het gelei tot die isolasie en die karakterisering van die PsAdV deur molekulêre en konvensionele tegnieke. Twee voëls wat moontlik blootgestel was aan PsAdV is geskenk aan dié laboratorium. Histopatalogiese toetse was reeds op die voëls uitgevoer deur ‘n veearts wat Adenovirale infeksie simptome aangemeld het. Die voëls was afkomstig vanaf dieselfde papegaai broeiplaas in die Vrystaat omgewing en beide is dood in September ‚ ’n jaar uitmekaar, wat moontlik ‘n seisoenale infeksie aandui. DNA is geëkstraheer uit gehomogeniseerde lewers van die papegaaie en ’n polimerasee ketting reaksie (PKR) gebruik as metode vir 'n vinnige diagnose van Adenovirale infeksie. ‘n Preimstuk paar wat die hexon geen boog 1 veranderlike gebied (L1), teenwoordig in twee gekonserveerde areas, is ontwerp aangesien die geen vir die hexon proteïen kodeer. Die groep, subgroep en tipe spesifieke antigeen bepalers word deur hierdie protein bepaal. ’n Verwagte produk grootte van ongeveer 587 bp is verkry vir al die monsters getoets. ’n Hoender Adenovirus (FAdV), ontvang van die Fakulteit van Veeartsenykundige wetenskappe, Onderstepoort (Pretoria) is gebruik as positiewe kontrole. Restriksie Fragment Lengte Polimorfisme (RFLP) is daaropvolgend gebruik om die verskille in die restriksie profiele van die positiewe DNA produkte te ondersoek. Die verdagte PsAdV monsters het dieselfde profiele gehad en die profiel was verskillend van die profiel verkry vanaf die hoender monster. Die PKR produk wat verkry is van die geïnfekteerde voëls, is in ’n pGEM-T Easy vektor geligeer en positiewe klone is na Inqaba Biotech gestuur vir DNA volgorde-bepaling. Die DNA volgorde wat ontvang is, was verder geanaliseer deur dit te vergelyk met data beskikbaar op die NCBI GenBank databasis. Hoë homologie is verkry teenoor die PsAdV DNA volgorde wat beskikbaar is op die databasis. Meervoudige groepering van beide die nukleotied en aminosuuropeenvolging het hoë homologie aangetoon met al die volgordes. Daar was verskille opgemerk met die proteïen opeenvolging, maar dit is gevind dat die verskillende aminosure in dieselfde aminosuur groepe val. Dit dui daarop aan dat die volgordes verkry afkomstig is vanaf dieselfde genogroepe. ’n Filogenetiese boom is opgestel en vier hoofgroeperings is verkry waar een van die groepe die PsAdV volgorde verteenwoordig. Die PsAdV groep is geskei vanaf die ander groepe met ‘n akkuraatheid waarde van 100%. Die twee kleiner vertakkings binne die groepe wat die UV volgordes skei van die verwysings PsAdV volgordes stel voor dat die UV monsters dalk verskillende isolate is. Die kweking van die virus in primêre hoender embrionale lewer selle in SPF embrionale eiers was suksesvol en sitopatiese effek (SPE), tipies van Adenovirusse, was gesien in die selle. Daar was duidelike verskille opgemerk tussen die geïnfekteerde embrio’s en die negatiewe kontrole. Hierdie is ook karakteristiek van Adenovirusse, veral die groep1 adenovirusse (AAVs). Ons stel voor dat verdere studies moet konsentreer opd ie ontwikkeling van antiliggame teen die PsAdV om sodoende serologiese tegnieke daar te stel om sodoende te onderskei tussen die verskillende serogroepe en isolate. Ons stel ook voor die ontwikkeling van ‘n vaksine teen hierdie psittacine Adenovirus.
Afrikaans: Gevalle van Adenovirale infeksies is onlangs in Suid-Afrikaanse psittacine voëls aangemeld. Diagnose van die voëls was gedoen deur na-doodse histologiese ondersoeke. Die Psittacine Adenovirus (PsAdV) word beskou as die tweede mees dodlikste virus in psittacine spesies met Psittacine Beak and Feather Disease virus (PBFD) die dodlikste. Daar is tans beperkte inligting beskikbaar ten opsigte van die verspreiding en die antigeniese karakterisering van die PsAdV in Suid-Afrika. Dit het gelei tot die isolasie en die karakterisering van die PsAdV deur molekulêre en konvensionele tegnieke. Twee voëls wat moontlik blootgestel was aan PsAdV is geskenk aan dié laboratorium. Histopatalogiese toetse was reeds op die voëls uitgevoer deur ‘n veearts wat Adenovirale infeksie simptome aangemeld het. Die voëls was afkomstig vanaf dieselfde papegaai broeiplaas in die Vrystaat omgewing en beide is dood in September ‚ ’n jaar uitmekaar, wat moontlik ‘n seisoenale infeksie aandui. DNA is geëkstraheer uit gehomogeniseerde lewers van die papegaaie en ’n polimerasee ketting reaksie (PKR) gebruik as metode vir 'n vinnige diagnose van Adenovirale infeksie. ‘n Preimstuk paar wat die hexon geen boog 1 veranderlike gebied (L1), teenwoordig in twee gekonserveerde areas, is ontwerp aangesien die geen vir die hexon proteïen kodeer. Die groep, subgroep en tipe spesifieke antigeen bepalers word deur hierdie protein bepaal. ’n Verwagte produk grootte van ongeveer 587 bp is verkry vir al die monsters getoets. ’n Hoender Adenovirus (FAdV), ontvang van die Fakulteit van Veeartsenykundige wetenskappe, Onderstepoort (Pretoria) is gebruik as positiewe kontrole. Restriksie Fragment Lengte Polimorfisme (RFLP) is daaropvolgend gebruik om die verskille in die restriksie profiele van die positiewe DNA produkte te ondersoek. Die verdagte PsAdV monsters het dieselfde profiele gehad en die profiel was verskillend van die profiel verkry vanaf die hoender monster. Die PKR produk wat verkry is van die geïnfekteerde voëls, is in ’n pGEM-T Easy vektor geligeer en positiewe klone is na Inqaba Biotech gestuur vir DNA volgorde-bepaling. Die DNA volgorde wat ontvang is, was verder geanaliseer deur dit te vergelyk met data beskikbaar op die NCBI GenBank databasis. Hoë homologie is verkry teenoor die PsAdV DNA volgorde wat beskikbaar is op die databasis. Meervoudige groepering van beide die nukleotied en aminosuuropeenvolging het hoë homologie aangetoon met al die volgordes. Daar was verskille opgemerk met die proteïen opeenvolging, maar dit is gevind dat die verskillende aminosure in dieselfde aminosuur groepe val. Dit dui daarop aan dat die volgordes verkry afkomstig is vanaf dieselfde genogroepe. ’n Filogenetiese boom is opgestel en vier hoofgroeperings is verkry waar een van die groepe die PsAdV volgorde verteenwoordig. Die PsAdV groep is geskei vanaf die ander groepe met ‘n akkuraatheid waarde van 100%. Die twee kleiner vertakkings binne die groepe wat die UV volgordes skei van die verwysings PsAdV volgordes stel voor dat die UV monsters dalk verskillende isolate is. Die kweking van die virus in primêre hoender embrionale lewer selle in SPF embrionale eiers was suksesvol en sitopatiese effek (SPE), tipies van Adenovirusse, was gesien in die selle. Daar was duidelike verskille opgemerk tussen die geïnfekteerde embrio’s en die negatiewe kontrole. Hierdie is ook karakteristiek van Adenovirusse, veral die groep1 adenovirusse (AAVs). Ons stel voor dat verdere studies moet konsentreer opd ie ontwikkeling van antiliggame teen die PsAdV om sodoende serologiese tegnieke daar te stel om sodoende te onderskei tussen die verskillende serogroepe en isolate. Ons stel ook voor die ontwikkeling van ‘n vaksine teen hierdie psittacine Adenovirus.
Description
Keywords
Dissertation (M.Sc. (Microbial, Biochemical and Food Biotechnology))--University of the Free State, 2007, Parrots -- Diseases, Adenoviruses, DNA viruses, Viruses -- Isolation, Hexon Gene, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Chicken Embryo Liver Cells, Specific pathogen free (SPF) embryonated eggs, Polymerase chain reaction (PCR), Psittacine Adenovirus (PsAdV)