Heterologous expression of extracellular proteins by Yarrowia lipolytica
Loading...
Date
2014-06
Authors
Mfumo, Nokukhanya Hlengiwe
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: The C. fumago chloroperoxidase (CPO) and human Granulocyte-Colony Stimulating Factor (hG-CSF) proteins require post-translation glycosylation modifications, contain intra molecular disulfide bonds for proper folding and biological activity, and have presented challenges when heterologously expressed in yeast, bacterial, insect cells and mammalian expression systems. The constraints associated with recombinant production of the proteins included toxicity to the host cell, inappropriate post-translational modifications, low production yields, improper protein folding, and lack of biological activity. The objective of this study was to explore the versatility of Y. lipolytica as host for expression and extracellular secretion of these two commercially significant proteins. The Y. lipolytica yeast was selected for its inherent ability to secrete a variety of proteins, its reported cotranslational translocation protein secretion pathway similar to that of mammalian systems, low overglycosylation, high protein secretion efficiency, good protein product yield, and heterologous protein production performance reproducibility. The codon optimized synthetic CPO and hG-CSF genes were cloned under the quasi constitutive growth dependent HP4D promoter or the inducible POX2 promoter in multicopy zeta based integrative expression systems using the Trimetes vesicolor laccase (LACC) or Y. lipolytica extracellular lipase (LIP2) secretion signals to target protein expression to the extracellular.
The CPO protein was expressed as an inactive extracellularly located protein judging by Western blot analysis using poly-Histidine antibody. The antibody detected the His tag fused to the C-terminus of the recombinant protein. The detection of this His tag suggested the failure by the Y. lipolytica to process through proteolytic cleavage, the 52 amino acid propeptide located at the C-terminal end of the protein. The 52 amino acid propeptide acts like a chaperone, being required to ensure correct CPO protein maturation, and its removal at a later stage during CPO secretion is required to yield an active CPO enzyme. The recombinant hG-CSF protein was successfully expressed in Y. lipolytica and purified by Ni-NTA affinity chromatography to homogeneity as judged by the single protein band with relative molecular mass of about 18 kDa. The protein was confirmed to be hG-CSF by peptide mapping using LC-MS/MS analysis. The biological activity of the expressed hG-CSF was found to be very low in comparison with the commercially available nonglycosylated hG-CSF. It remains to be determined if the His tag fused to the C-terminal end of the recombinant protein affected the biological activity of the recombinant hG-CSF. The possible explanation for the low biological activity could be the cultivation conditions that did not take into account pH ranges at which hG-CSF retains stability.
The study demonstrated the potential application of the Y. lipolytica yeast as platform for production of recombinant CPO and hG-CSF proteins. The proteins were successfully expressed and secreted to the extracellular. However, the SDS-PAGE analysis revealed that the CPO on the extracellular was less pronounced as compared to hG-CSF protein. Most importantly, this study provided insights on the requirements that have to be considered when developing the Y. lipolytica yeast as production systems for recombinant CPO and hG-CSF. The future attempts in heterologous expression of CPO enzyme in Y. lipolytica need to include development of platforms to co-express compatible endoprotease genes to enable efficient processing of the chaperonic 52 amino acid long carboxyl terminal propetide. The factors to be considered in future studies on the production of hG-CSF protein would entail the design of appropriate cultivation conditions to enhance the stability of hG-CSF during production, and the use of Y. lipolytica strains deleted for the yeast glycosylation pathway.
Afrikaans: Die C. fumago chloroperoksidase (CPO) en menslike Granulosiet-kolonie stimulerende faktor (hG-CSF) proteïene benodig post-translasie glikosileringveranderinge en bevat intra-molekulêre disulfiedbindings vir 'n behoorlike vouïng en biologiese aktiwiteit. Dit bied dus uitdagings wanneer dit heteroloog uitgedruk word in gis, bakteriële, insek en soogdier uitdrukkingsisteme. Die beperkinge wat verband hou met rekombinante produksie van die proteïen sluit in toksisiteit vir die gasheersel, onvanpaste post-translasie modifikasies, lae produksie opbrengste, onbehoorlike proteïenvouing en 'n gebrek aan biologiese aktiwiteit. Die doel van hierdie studie was om die veelsydigheid van Y. lipolytica as gasheer vir die uitdrukking en ekstrasellulêre uitskeiding van hierdie twee kommersieel belangrike proteïene te ondersoek. Die Y. lipolytica gis is gekies vir sy inherente vermoë om 'n verskeidenheid proteïene uit te skei, sy gerapporteerde ko-translokasie proteïen uitskeidingsweg, soortgelyk aan dié van ander soogdier sisteme, lae oor-glikosilering, hoë proteïen uitskeiding doeltreffendheid, goeie proteïen produk opbrengs en reproduseerbare hoë heteroloë proteïen produksie. Die kodon geöptimiseerde, gesintetiseerde CPO en hG-CSF gene is gekloneer onder die kwasi konstitutiewe, groei-afhanklike hp4d promotor of die induseerbare POX2 promotor multikopie zeta gebaseerde geïntegreerde uitdrukkingstelsels met behulp van die Trimetes vesicolor laccase (LACC) of Y. lipolytica ekstrasellulêre lipase (LIP2) uitskeidingseine om proteïen uitdrukking na die ekstrasellulêre medium te teiken. Die CPO proteïen is uitgedruk as 'n onaktiewe ekstrasellulêre proteïen volgens die Western-klad analise gedoen met poli-Histidien teenliggaampies. Die teenliggaampies bespeur die His-gemerkte C-terminus van die rekombinante proteïen. Die teenwoordigheid van die His-merker dui daarop dat Y. lipolytica nie instaat was tot proteolitiese splyting van die 52 aminosuur propeptide geleë op die C-terminus van die proteïen. Die 52 aminosuur propeptide tree op as 'n chaperone, en is noodsaaklik vir korrekte prosessering van die CPO proteïen. Verwydering op 'n later stadium tydens CPO uitskeiding is noodsaaklik om 'n aktiewe CPO ensiem te verkry. Die rekombinante hG-CSF proteïen is suksesvol uitgedruk in Y. lipolytica en gesuiwer deur Ni-NTA affiniteitschromatografie on 'n suiwer proteïen te lewer te oordeel aan die enkele proteïen-band met relatiewe molekulêre massa van ongeveer 18 kDa. Die proteïen is geïdentifiseer as hG-CSF deur peptied kartering met behulp van LC-MS / MS analise. Die biologiese aktiwiteit van die uitgedrukte hG-CSF was baie laag in vergelyking met die kommersieel beskikbare nie-geglikosideerde hG-CSF. Dit moet nog bepaal word of die His-merker aan die C-termius van die rekombinante proteïen die biologiese aktiwiteit van die rekombinante hG-CSF benadeel. 'n Ander moontlike verklaring vir die lae biologiese aktiwiteit kan wees dat die pH waarby proteïen produksie plaasgevind het nie die effek van pH op die stabilitiet van hG-CSF in ag geneem het nie. Die studie toon die potensiaal van die Y. lipolytica gis as platform vir die produksie van rekombinante CPO en hG-CSF proteïene. Die proteïene is suksesvol uitgedruk en uitgeskei na die ekstrasellulêre medium. SDS-PAGE analise het getoon dat die CPO teen laer vlakke uitgedruk is as die hG-CSF proteïen. Hierdie studie het belangrike insigte gelewer oor die vereistes wat in ag geneem moet word tydens die ontwikkeling van die Y. lipolytica gis as produksiestelsels vir rekombinante CPO en hG-CSF. Toekomstige pogings om CPO ensiem in Y. lipolytica uit te druk moet versoenbaar wees met die verwydering van die 52 aminosuur C-terminale propeptied deur endoproteases. Die faktore wat in ag geneem moet word in toekomstige studies op die produksie van hG-CSF proteïen moet insluit produksie toestande wat stabiliteit van die hG-CSF proteïen sal verseker en die gebruik van Y. lipolytica stamme waarvan die gis glikosideringsweg geïnaktiveer is.
Afrikaans: Die C. fumago chloroperoksidase (CPO) en menslike Granulosiet-kolonie stimulerende faktor (hG-CSF) proteïene benodig post-translasie glikosileringveranderinge en bevat intra-molekulêre disulfiedbindings vir 'n behoorlike vouïng en biologiese aktiwiteit. Dit bied dus uitdagings wanneer dit heteroloog uitgedruk word in gis, bakteriële, insek en soogdier uitdrukkingsisteme. Die beperkinge wat verband hou met rekombinante produksie van die proteïen sluit in toksisiteit vir die gasheersel, onvanpaste post-translasie modifikasies, lae produksie opbrengste, onbehoorlike proteïenvouing en 'n gebrek aan biologiese aktiwiteit. Die doel van hierdie studie was om die veelsydigheid van Y. lipolytica as gasheer vir die uitdrukking en ekstrasellulêre uitskeiding van hierdie twee kommersieel belangrike proteïene te ondersoek. Die Y. lipolytica gis is gekies vir sy inherente vermoë om 'n verskeidenheid proteïene uit te skei, sy gerapporteerde ko-translokasie proteïen uitskeidingsweg, soortgelyk aan dié van ander soogdier sisteme, lae oor-glikosilering, hoë proteïen uitskeiding doeltreffendheid, goeie proteïen produk opbrengs en reproduseerbare hoë heteroloë proteïen produksie. Die kodon geöptimiseerde, gesintetiseerde CPO en hG-CSF gene is gekloneer onder die kwasi konstitutiewe, groei-afhanklike hp4d promotor of die induseerbare POX2 promotor multikopie zeta gebaseerde geïntegreerde uitdrukkingstelsels met behulp van die Trimetes vesicolor laccase (LACC) of Y. lipolytica ekstrasellulêre lipase (LIP2) uitskeidingseine om proteïen uitdrukking na die ekstrasellulêre medium te teiken. Die CPO proteïen is uitgedruk as 'n onaktiewe ekstrasellulêre proteïen volgens die Western-klad analise gedoen met poli-Histidien teenliggaampies. Die teenliggaampies bespeur die His-gemerkte C-terminus van die rekombinante proteïen. Die teenwoordigheid van die His-merker dui daarop dat Y. lipolytica nie instaat was tot proteolitiese splyting van die 52 aminosuur propeptide geleë op die C-terminus van die proteïen. Die 52 aminosuur propeptide tree op as 'n chaperone, en is noodsaaklik vir korrekte prosessering van die CPO proteïen. Verwydering op 'n later stadium tydens CPO uitskeiding is noodsaaklik om 'n aktiewe CPO ensiem te verkry. Die rekombinante hG-CSF proteïen is suksesvol uitgedruk in Y. lipolytica en gesuiwer deur Ni-NTA affiniteitschromatografie on 'n suiwer proteïen te lewer te oordeel aan die enkele proteïen-band met relatiewe molekulêre massa van ongeveer 18 kDa. Die proteïen is geïdentifiseer as hG-CSF deur peptied kartering met behulp van LC-MS / MS analise. Die biologiese aktiwiteit van die uitgedrukte hG-CSF was baie laag in vergelyking met die kommersieel beskikbare nie-geglikosideerde hG-CSF. Dit moet nog bepaal word of die His-merker aan die C-termius van die rekombinante proteïen die biologiese aktiwiteit van die rekombinante hG-CSF benadeel. 'n Ander moontlike verklaring vir die lae biologiese aktiwiteit kan wees dat die pH waarby proteïen produksie plaasgevind het nie die effek van pH op die stabilitiet van hG-CSF in ag geneem het nie. Die studie toon die potensiaal van die Y. lipolytica gis as platform vir die produksie van rekombinante CPO en hG-CSF proteïene. Die proteïene is suksesvol uitgedruk en uitgeskei na die ekstrasellulêre medium. SDS-PAGE analise het getoon dat die CPO teen laer vlakke uitgedruk is as die hG-CSF proteïen. Hierdie studie het belangrike insigte gelewer oor die vereistes wat in ag geneem moet word tydens die ontwikkeling van die Y. lipolytica gis as produksiestelsels vir rekombinante CPO en hG-CSF. Toekomstige pogings om CPO ensiem in Y. lipolytica uit te druk moet versoenbaar wees met die verwydering van die 52 aminosuur C-terminale propeptied deur endoproteases. Die faktore wat in ag geneem moet word in toekomstige studies op die produksie van hG-CSF proteïen moet insluit produksie toestande wat stabiliteit van die hG-CSF proteïen sal verseker en die gebruik van Y. lipolytica stamme waarvan die gis glikosideringsweg geïnaktiveer is.
Description
Keywords
Dissertation (M.Sc. (Microbial, Biochemical and Food Biotechnology))--University of the Free State, 2014, Yeast, Yeast (Cytology), Proteins, Recombinant proteins