Development and validation of assay methods for the quantitative determination of drugs and their metabolites in biological specimens (piroxicam and nabumetone)
Loading...
Date
2001-05
Authors
De Jager, Andrew David
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: The development and validation of bioanalytical assay methods suitable for the quantitation
of drugs in biological matrices is discussed, as well as general principles applicable to this
particular aspect of drug development. Relevant literature is consulted, with a view to
exemplifying what constitutes good assay method development strategy, as well as to reflect
current international policy in this field, with particular reference to bioequivalence studies.
Comparisons are made between international practices and those in place at FARMOVSPAREXEL
Bioanalytical Services Division®. Attention is given inter alia to detector
selection, chromatographic optimisation, extraction procedures and method validation, with
reference to new assay methods for two drugs in particular that have been developed and
validated according internationally acceptable standards. In the first instance, a highperformance
liquid chromatographic method with ultraviolet detection was developed for the
determination of 6-methoxy-2-naphthylacetic acid (6-MNA, the active metabolite of
nabumetone ). The sample preparation involved a simple but effective protein precipitation
procedure. Reversed-phase liquid chromatography was optimised, and full resolution
between the analyte and endogenous matrix peaks achieved in a chromatographic runtime of
five minutes. The assay method was validated over a range of plasma concentrations
between 0.070 and 145 µg/ml. 1242 Plasma samples generated during a comparative
bioequivalence study were then assayed and the performance of the assay method shown to
be well within accepted international norms. The coefficient of variation for quality control
standards over the range of 0.18 to 39 µg/ml processed during the assaying of the study
samples, varied between 3.6 and 8.1 %.
In the second instance, a novel method for the determination of piroxicam in four biological
matrices (sub-cutaneous tissue (SCT), synovial fluid (SF), synovial capsule (SC) and
plasma) was developed. A double back-extraction procedure was followed by reversed-phase
liquid chromatography and electrochemical detection (ECD). Extracts from all four
biological matrices were injected onto a single HPLC system. Ratios between plasma and the
three remaining matrices were used to characterise transdermal absorption of two topical
preparations of piroxicam when applied to the knee. Low systemic levels associated with
topical formulations necessitated the development and validation of a highly sensitive assay
method. Plasma was used as a surrogate matrix for all the processed tissue samples and the
assay method was validated over a range of plasma concentrations between 1.24 and 600
ng/ml. 168 Samples generated during a multi-centre study involving knee replacement
surgery, were assayed and the performance of the assay method shown to be well within
accepted international norms. The coefficient of variation for quality control standards over
the range of 1.74 to 300 ng/ml processed during the assaying of the study samples, varied
between 7.7 and 13.5 % which can be considered excellent in the light of the complexity of
the sample preparation process.
Analytical data generated during the above-mentioned two research projects are discussed,
with novelties and improvements to existing assay methods being elucidated. Both assay
methods were presented and accepted for publication in peer reviewed scientific journals.
Both full-length publications are included in an appendix in this dissertation, together with
the correspondence entered into with journal editors and referees. Furthermore, a section
containing copies of the slides used to present the latter HPLC assay method as an oral
presentation at the 1998 Annual Congress of the South African Pharmacological Society, is
included.
Afrikaans: Die ontwikkeling en validering van bioanalitiese metodes wat vir die kwantifisering van geneesmiddels in biologiese monsters toepaslik is, asook algemene beginsels wat van toepassing is op hierdie aspek van geneesmiddelontwikkeling, word bespreek. Relevante literatuur is geraadpleeg met die doelom voorbeelde van sinvolle strategieë vir die ontwikkeling van bioanalitiese metodes uit te lig asook om huidige internasionale praktyke, veral ten opsigte van bioekwivalensiestudies, te reflekteer. In die verhandeling word vergelykings tussen bogenoemde praktyke en dié by FARMOVS-P AREXEL Bioanalytical Services Division® getref. Onder andere word aandag aan die keuse van die detektor, chromatografiese optimisering, monster voorbereiding en validering van twee nuwe analitiese metodes gewy wat albei ontwikkel en valideer is volgens internasionaal aanvaarde standaarde. Eerstens is 'n hoë-verrigting vloeistofchromatogra-fiese metode met ultravioletdeteksie vir die bepaling van 6-metoksie-2-naftiel asynsuur (6-MNA, die aktiewe metaboliet van nabumetoon) ontwikkel. Die monstervoorbereiding behels 'n eenvoudige maar baie effektiewe proteïen presipitasie van plasmamonsters gevolg deur omgekeerde vloeistofchromatografie. Die sisteem is geoptimiseer en skeiding tussen die analiet en endogene plasmakomponente geskied binne die bestek van 'n vyf minute chromatografielopie. Die metode is oor 'n bereik van 0.070 en 145 µg/rnl plasmakonsentrasies gevalideer. 1242 Plasmamonsters wat gedurende ,n vergelykende biobeskibaarheidsstudie verkry is, is dan geanaliseer en die verrigting van die analitiese metode was gemaklik binne aanvaarde internasionale norme. Die variasiekoëffisiënt van die kwaliteitskontroles wat in die studie saam met die studiemonsters geproseseer is, en wat oor 'n konsentrasiebereik van 0.070 en 145 µg/ml gestrek het, het gevariëer tussen 3.6 en 8.1 %. Die tweede navorsingsstuk behels die bepaling van piroksikam in vier verskillende biologiese matrikse (subkutane weefsel, sinoviale kapsel, sinoviale vog en plasma). 'n Dubbele terug-ekstraksie, gevolg deur omgekeerde fase vloeisstof-chromatografie en elektrochemiese deteksie was angewend om piroksikam te kwantifiseer. Ekstrakte uit elk van die vier verskillende matrikse is op 'n enkele HPLC sisteem ingespuit. Verhoudings tussen plasmakonsentrasie en die konsentrasie van piroksikam in die drie oorblywende matrikse is bereken om die transdermale absorpsie van piroksikam uit twee topikaal, op die knie aangewende preparate, te karakteriseer. Aangesien die aanwending van topikale piroksikam gelpreparate maar baie lae sistemiese piroksikarnkonsentrasies lewer, was dit nodig om 'n baie sensitiewe analitiese te ontwikkel. Plasma was gebruik as 'n surrogaatmatriks vir die geproseseerde weefselmonsters en die analitiese metode was gevalideer oor 'n plasmakonsentrasie-bereik van 1.24 tot 600 ng/ml. 168 Monsters wat ontvang is uit 'n multisentriese studie waarby knievervangssjirurgie betrokke was, is geanaliseer en die verrigting van die bepalingsmetode was gemaklik binne die internasionaal aanvaarde norme. Die variasiekoëffisiënt van die kwaliteitskontroles wat in die studie saam met die studiemonsters geproseseer is, en wat oor 'n konsentrasiebereik van 1.70 en 300 ng/ml gestrek het, het gevariëer tussen 7.7 en 13.5 % wat as uitstekend gereken kan word in die lig van die kompleksiteit van die monstervoorbereiding. Analitiese gegewens wat gedurende die twee bogenoemde navorsingsprojekte versamel is , word bespreek, en veral verbeteringe en nuwighede ten opsigte van bestaande bepalingsmetodes word uitgelig. Beide bepalingsmetodes is vir publikasie in aanstaande wetenskaplike joernale aanvaar en beide vollengte publikasies verskyn as bylae tot hierdie verhandeling tesame met alle korrespondensie wat met die j oumaal redakteur en referente aangegaan is. Verder is 'n bylaag ingesluit wat die skyfies bevat wat tydens die 1998 Jaarlikse Kongres van die Suid Afrikaanse Farmakologievereniging gebruik is in 'n mondelinge voordrag oor die piroksikam bepalingsmetode.
Afrikaans: Die ontwikkeling en validering van bioanalitiese metodes wat vir die kwantifisering van geneesmiddels in biologiese monsters toepaslik is, asook algemene beginsels wat van toepassing is op hierdie aspek van geneesmiddelontwikkeling, word bespreek. Relevante literatuur is geraadpleeg met die doelom voorbeelde van sinvolle strategieë vir die ontwikkeling van bioanalitiese metodes uit te lig asook om huidige internasionale praktyke, veral ten opsigte van bioekwivalensiestudies, te reflekteer. In die verhandeling word vergelykings tussen bogenoemde praktyke en dié by FARMOVS-P AREXEL Bioanalytical Services Division® getref. Onder andere word aandag aan die keuse van die detektor, chromatografiese optimisering, monster voorbereiding en validering van twee nuwe analitiese metodes gewy wat albei ontwikkel en valideer is volgens internasionaal aanvaarde standaarde. Eerstens is 'n hoë-verrigting vloeistofchromatogra-fiese metode met ultravioletdeteksie vir die bepaling van 6-metoksie-2-naftiel asynsuur (6-MNA, die aktiewe metaboliet van nabumetoon) ontwikkel. Die monstervoorbereiding behels 'n eenvoudige maar baie effektiewe proteïen presipitasie van plasmamonsters gevolg deur omgekeerde vloeistofchromatografie. Die sisteem is geoptimiseer en skeiding tussen die analiet en endogene plasmakomponente geskied binne die bestek van 'n vyf minute chromatografielopie. Die metode is oor 'n bereik van 0.070 en 145 µg/rnl plasmakonsentrasies gevalideer. 1242 Plasmamonsters wat gedurende ,n vergelykende biobeskibaarheidsstudie verkry is, is dan geanaliseer en die verrigting van die analitiese metode was gemaklik binne aanvaarde internasionale norme. Die variasiekoëffisiënt van die kwaliteitskontroles wat in die studie saam met die studiemonsters geproseseer is, en wat oor 'n konsentrasiebereik van 0.070 en 145 µg/ml gestrek het, het gevariëer tussen 3.6 en 8.1 %. Die tweede navorsingsstuk behels die bepaling van piroksikam in vier verskillende biologiese matrikse (subkutane weefsel, sinoviale kapsel, sinoviale vog en plasma). 'n Dubbele terug-ekstraksie, gevolg deur omgekeerde fase vloeisstof-chromatografie en elektrochemiese deteksie was angewend om piroksikam te kwantifiseer. Ekstrakte uit elk van die vier verskillende matrikse is op 'n enkele HPLC sisteem ingespuit. Verhoudings tussen plasmakonsentrasie en die konsentrasie van piroksikam in die drie oorblywende matrikse is bereken om die transdermale absorpsie van piroksikam uit twee topikaal, op die knie aangewende preparate, te karakteriseer. Aangesien die aanwending van topikale piroksikam gelpreparate maar baie lae sistemiese piroksikarnkonsentrasies lewer, was dit nodig om 'n baie sensitiewe analitiese te ontwikkel. Plasma was gebruik as 'n surrogaatmatriks vir die geproseseerde weefselmonsters en die analitiese metode was gevalideer oor 'n plasmakonsentrasie-bereik van 1.24 tot 600 ng/ml. 168 Monsters wat ontvang is uit 'n multisentriese studie waarby knievervangssjirurgie betrokke was, is geanaliseer en die verrigting van die bepalingsmetode was gemaklik binne die internasionaal aanvaarde norme. Die variasiekoëffisiënt van die kwaliteitskontroles wat in die studie saam met die studiemonsters geproseseer is, en wat oor 'n konsentrasiebereik van 1.70 en 300 ng/ml gestrek het, het gevariëer tussen 7.7 en 13.5 % wat as uitstekend gereken kan word in die lig van die kompleksiteit van die monstervoorbereiding. Analitiese gegewens wat gedurende die twee bogenoemde navorsingsprojekte versamel is , word bespreek, en veral verbeteringe en nuwighede ten opsigte van bestaande bepalingsmetodes word uitgelig. Beide bepalingsmetodes is vir publikasie in aanstaande wetenskaplike joernale aanvaar en beide vollengte publikasies verskyn as bylae tot hierdie verhandeling tesame met alle korrespondensie wat met die j oumaal redakteur en referente aangegaan is. Verder is 'n bylaag ingesluit wat die skyfies bevat wat tydens die 1998 Jaarlikse Kongres van die Suid Afrikaanse Farmakologievereniging gebruik is in 'n mondelinge voordrag oor die piroksikam bepalingsmetode.
Description
Keywords
Method development, Validation, Drug development, Bioequivalence, High-performance liquid chromatography, Plasma, Sub-cutaneous tissue synovial capsule, Synovial fluid, Biological assay, Drugs -- Analysis, Dissertation (M.Med.Sc. (Pharmacology))--University of the Free State, 2001