Molecular and kinetic properties of recombinant Bacillus lipase
Loading...
Date
2001-10
Authors
Nthangeni, Mulalo Bethuel
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: Lipases (EG 3.1.1.3) catalyze the hydrolysis of triacylglycerols and occur widely
in nature. The lipase-catalysed reaction is reversible and a wide range of transand
interesterification reactions can be catalyzed. These enzymes could be used
to manufacture products which could not be obtained by conventional chemical
processes, and as the advantages of the use of lipases relative to traditional
chemical processes are more recognized, lipases may be expected to gain even
more importance in the enzyme market. For these purposes, new lipases with a
wide range of novel characteristics are required.
Bacterial isolates collected mainly from alkaline dairy washes were screened for
lipase production on agar plates containing Rhodamine B/olive oil, Tween
BO/GaGb and tributyrin. Isolates that showed lipase production on agar plates
were investigated for lipase production in liquid cultures in the presence of
different carbon sources. Bacillus licheniformis and Bacillus pumilus were
identified as best producers of lipase on the basis of relative activity, pH and
temperature optimum using p-Nitrophenyl palmitate as the assay substrate.
The production of extracellular lipase by Bacillus licheniformis in the presence of
selected carbohydrates and lipidic substrates was investigated. The
microorganism could not grow in mineral medium containing Tween 20, Tween
BD and caproic and caprylic acids. Although the mineral medium supplemented
with tributyrin, triolein, olive oil, tricaprylin, glycerol and glucose supported growth
of the microorganism, no lipase production was detected; probably as a result of
the lack of the lipase inducing factor. When the microorganism was grown on
nutrient broth, lipase activity of about 600 units/I was achieved. This indicated the
presence of the lipase producing components in the rich nutrient broth medium.
Production of extracellular lipase was repressed by the addition of
triacylglycerols, free fatty acids, glycerol and glucose. The repressive effects of
triacylglycerols were found to be more rapid and pronounced as compared to the
effects of free fatty acids and glycerol alone. The increased repressive effects of
triacylglycerols could have occurred as a result of compounded effects of glycerol
and free fatty acids, which are the hydrolytic products when the lipase hydrolyses
the triacylglycerols. These observations suggested synergistic effect or the
presence of two independent pathways by which free fatty acids and glycerol
repress the production of lipase by Bacillus licheniformis.
Addition of detergents Tween 20 and Tween 80 enhanced the production of
lipases by the microorganism. The extracellular lipase activity increased to levels
of about 2000 units/I in the presence of the detergent.
The purification of the lipase from Bacillus licheniformis was attempted using a
combination of ion-exchange chromatography, hydrophobic interaction
chromatography, hydroxylapatite and size exclusion chromatography. However,
aggregation of lipase protein, lack of interaction, and irreversible interaction with
chromatography resins resulted in only partially pure lipase preparations.
The partially purified lipases showed biochemical properties similar to lipases
produced by Bacillus pumilus and Bacillus subtilis. The three lipases are
thermolabile, alkali tolerant and function optimally in alkaline pH conditions. The
cloning and sequencing of the lipase gene from Bacillus pumilus isolate followed
by amino acid analysis revealed high sequence homology suggesting similar
protein folds. This led to the hypothesis that the mature lipase secreted by
Bacillus Iicheniformis could have significant homology with the mature lipase
secreted by the other two Bacillus species.
Degenerate primers were consequently designed based on the sequences of
mature lipases secreted by Bacillus pumilus and Bacillus subtilis. The primers
amplified a DNA fragment of 560 bp encoding lipase activity with Bacillus
Iicheniformis genomic DNA as the template. The DNA fragment encoding the
mature lipase of Bacillus Iicheniformis was subcloned into the pET 20b(+)
expression vector to construct a recombinant lipase protein containing 6 histidine
residues at the C-terminal. High-level expression of the lipase by Escherichia coli
cells harbouring the lipase gene-containing expression vector was observed
upon induction with IPTG at 30°C. A one step purification of the recombinant
lipase was achieved with Ni-NTA resin. The histidine tag was removed by
creating a 6X His-tag at the N-terminal of the protein followed by a rTEV protease
cleavage site. The lipase protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography
followed by cleavage with rTEV protease to remove the histidine tag. The Cterminal
His-tagged and the non-tagged lipase proteins were characterized.
The specific activity of the purified enzyme was about 130 units/mg with pnitrophenyl-
palmitate as substrate. The enzyme showed maximum activity at pH
9.5-11.5 and was remarkably stable at alkaline pH values up to 20 hours. The Cterminal
histidine tag was found to enhance the specific activity of the lipase in
pH conditions between 10-11.5. The enzyme showed maximal activities toward
p-nitrophenyl esters and triacylglycerols containing C6 and Ca fatty acyl groups.
The metals that affected the lipase significantly were divalent Co, Zn and Hg
which decreased the activity to less than 30% with Hg abolishing all the lipase
activity. The enzyme was not inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid
(EDTA), dithiothreitol (DTT), or mercaptoethanol, while the classical serine
protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) decreased the lipase
activity to 40% at 1 mM concentration.
The amino acid sequence of the lipase shows striking similarities to lipases from
Bacillus subtilis and Bacillus pumilus. Based on the amino acid identity and
biochemical characteristics, we classified Bacillus licheniformis lipase as a
member of Family 1.4 lipases, together with lipolytic enzymes produced by
Bacillus subtilis and Bacillus pumilus. The consensus sequence of the lipases
around the nucleophilic Ser deviated from the canonical Gly-X-Ser-X-Gly. In the
three Bacillus lipases, the consensus sequence was found to be Ala-His-Ser-XGly.
This motif is shared with another group of larger lipases produced by
thermophilic Bacillus species.
Site-directed mutagenesis of the Ala and His residues near the nucleophilic Ser
suggested that the lipase enzymes acquired the amino acids during evolution for
optimal activity and enhanced thermal stability. Asp133, His 156 together with
Ser?? were identified by site-directed mutagenesis as residues that form the
catalytic triad of the lipase enzyme. This was confirmed by the three-dimensional
structure model built using Bacillus subtilis Lipase A as the template.
While in pursuit of cloning the promoter region of Bacillus licheniformis lipase
gene, a 3.5 kb DNA fragment that showed lipolytic activity on tributyrin agar plate
was obtained. Sequence analysis of the cloned DNA fragment revealed that a
new carboxyl esterase gene with an open reading frame encoding a protein of
484 amino acids with estimated molecular mass of 53 kDa and a pi of 5.4 had
been cloned. The cloned protein showed high amino acid identity with industrially
significant enzymes belonging to the esterase family.
This study has advanced the biochemical knowledge on lipases secreted by
Bacillus species. Although the biochemical properties of Bacillus lipases are
becoming known, the molecular mechanisms regulating the biosynthesis of the
enzymes remain unknown. Future studies should therefore also attempt to
elucidate the molecular mechanisms of Bacillus lipase biosynthesis. This would
facilitate the bioengineering of Bacillus species to produce inducible lipase
enzyme at quantities enough for application in for example, detergent and leather
tanning industries. Current studies aimed at the cloning of the promoter region of
the lipase from Bacillus licheniformis should be continued for the purpose of
understanding the molecular regulation of the gene.
The role of Bacillus lipases in biocatalytic resolution of racemic mixtures has not
been fully explored. The recent availability of the three-dimensional structure of
Family 1.4 lipases will enable us to understand the structural determinants of
lipase properties and to construct Bacillus lipases that suit desired functions. As
an example, the mature lipase produced by Bacillus pumilus (UOFS) is more
than 95% identical to Bacillus lichenifomis lipase at amino acid level, but the
latter lipase shows a broader alkaline optimum pH profile. The determinant for
the broad alkaline pH profile has not yet been identified.
The new carboxyl esterase gene cloned in this study should be over-expressed
and biochemically characterized. The biotechnological applicability for the
enzyme should be assessed.
Afrikaans: Lipases (E.C. 3.1.1.3), wat wyd in die natuur voorkom, kataliseer die hidrolise van triasielgliserole. Die lipase-gekataliseerde reaksie is omkeerbaar en 'n wye verskeidenheid trans- en interesterifiseringreaksies is moontlik. Die ensieme kan die sintese van produkte wat nie gewoonweg deur konvensionele chemiese metodes gemaak kan word, nie moontlik maak, en daar kan verwag word dat, soos die toepaslikheid van ltpases meer bekend word, hulle steeds belangriker in die ensiem mark sal word. Daarom sal nuwe lipases met nuwe eienskappe benodig word. Bakteriese isolate wat hoofsaaklik van alkaliese melkery afloopwater versamel is, is op Rhodamien B/olyfolie-, Tween 80/CaC12- en tributirien-bevattende agarplate getoets. Isolate wat lipase vervaardig het, is in skudkulture vir lipase-produksie in die teenwoordigheid van verskillende koolstofbronne getoets. Bacillus licheniformis en Bacillus pumilus is as die beste lipase-produseerders geïdentifiseer met p-nitrofeniel palmitaat as toetssubstraat en deur relatiewe aktiwiteit, optimum pH en temperatuur as maatstaf te gebruik. Lipase produksie deur Bacillus licheniformis is ondersoek in die teenwoordigheid van verskillende koolhidrate en lipiedsubstrate. Die mikro-organisme kon nie groei in 'n mineraalmedium wat met Tween 20, Tween 80, kaproësuur of kaprillensuur gesupplementeer was nie. Dieselfde medium met tributirien, trioleïen, olyfolie, gliserol of glukose gesupplementeer is, kon groei ondersteun maar geen lipase aktiwiteit kon gemeet word nie, waarskynlik weens die gebrek aan 'n induksiefaktor. Dit het daarop gedui dat daar in 'n ryk voedingsop medium waarskynlik 'n lipase induseerder teenwoordig was. Die byvoeging van triasielgliserole, vrye vetsure, gliserol of glukose het die produksie van die ekstrasellulêre lipase onderdruk. Die onderdrukkende effek van triasielgliserole was vinniger en sterker as die van vetsure of gliserol afsonderlik, moontlik as gevolg van die gesamentlike effek van die twee verbindings wat beide die produkte van hidrolise is. Die waarnemings het gedui op 'n sinergistiese effek van moontlik twee afsonderlike bane waar deur vrye vetsure en gliserol die produksie van Bacillus licheniformis lipase onderdruk. Byvoeging van Tween 20 of Tween 80 het die produksie van lipases deur die organisme versterk en 'n toename tot so veel as 2000 eenhede/ml veroorsaak. Suiwering van die lipase is deur middel van 'n kombinasie van ioonuitruilings-, hidrofobiese interaksie-, hidroksielapatiet- en uitsluitingschromatografie was onsuksesvol. Aggregasie, 'n gebrek aan interaksie met die kolommedia of onomkeerbare binding van die lipase-proteïen aan die chromatografiemedium het die suiwering bemoeilik en slegs 'n gedeeltelik-gesuiwerde proteïen kon verkry word. Die lipasepreparaat het dieselfde eienskappe as dié van Bacillus pumi!is en Bacillus subti!is getoon. AI drie ensieme was termies labiel, kon alkali tolereer en het optimaal in alkaliese medium gefunksioneer. Die klonering en nukleotiedvolgordebepaling van die lipase geen van 'n Bacillus pumi!is isolaat het daarop gedui dat hierdie lipase en die een van Bacillus subti!is dieselfde struktuur kon hê. Dit kon daarop dui dat die lipase van Bacillus !icheniformis beduidende homologie met die ensiem van die ander twee bacilli kon toon. Degenererende voorlopers is, met die nukleotiedopeenvolging van die Bacillus pumi!is en Bacillus subti!is as basis, ontwerp. 'n DNA fragment van 560 basispare wat vir lipase aktiwiteit kodeer en met die genomiese DNA as templaat, is met die gebruik van die voorlopers geamplifiseer. Die DNA fragment wat vir die lipase kodeer is in 'n pET 20b(+) uitdrukkingsvektor gesubkloneer om 'n lipase konstruk te verkry met 6 histidienresidue aan die C-terminale van die proteïen toegevoeg. Hoë uitdrukkingsvlakke van die lipase is verkry met Escherichia coli selle wat die vektor bevat na induksie met IPTG by 30°C. 'n Enkel stap suiweringsprosedure deur chromatografie op Ni-NTA chromatografiemedium het gevolg. Die histidien merker kon verwyder word deur 'n 6X histidien volgorde aan die N-terminale punt van die proteïen te heg en dit na proteïenuitdrukking met rTEV protease te verwyder, Suiwering van die volledig geprosesseerde ensiem was daarna op die Ni-NTA kolom moontlik. Die ensiem met die C-terminale histidien merker sowel as die volledig geprosesseerde ensiem is daarna gekarakteriseer. Die gesuiwerde ensiem het 'n spesifieke aktiwiteit van 130 eenhede/mg getoon met p-nitrofeniel palmitaat as substraat. Die ensiem was maksimaal aktief by pH van 9.5-11 en was besonder stabiele by alkaliese pH tot by pH 12. Die Cterminale histidien merker het die lipase aktiwiteit by pH 10-11.5 versterk. Die ensiem was maksimaal aktief met p-nitrofeniel esters of triasielgliserole met C6 of Ca asielgroepe. Divalente Co, Zn, en Hg het die grootste effek op die aktiwiteit gehad; eersgenoemde twee het die aktiwiteit tot minder as 30% laat afneem terwyl Hg die ensiem totaal gedeaktiveer het. Die ensiem was nie deur EDTA, ditiotreïtol of merkaptoetanol geïnhibeer nie maar die klassieke serien proteaseinhibeerder, feniel-metiel-sulfonielfluoried (PMSF) (1mM) het die lipaseaktiwiteit tot minder as 40% van die kontrole laat afneem. Die aminosuuropeenvolging van die lipase het besondere ooreenkomste met lipases van Bacillus subtilis en Bacillus pumilis getoon. Met aminosuuropeenvolging en biologiese eienskappe as maatstaf is die Bacillus licheniformis lipase as 'n lid van die Familie 1.4 lipase geklassifiseer, saam met die lipases van Bacillus subtilis en Bacillus pumilis. Die konsensus-opeenvolging in die omgewing van die nukleofiliese serien het van die gewone Gly-X-Ser-X-Gly afgewyk. In die Bacillus lipases is die opeenvolging Ala-His-Ser-X-Gly, 'n motief wat ook in die groep groter lipases van die termofiele Bacillus spesies. Setelgerigte mutagenese van die Ala en His residue na-aan die nukleofiliese Ser het aangedui dat die lipase-ensieme dié aminosure verkry het, waarskynlik tydens evolusie vir optimale aktiwiteit en verhoogde termiese stabiliteit. Asp133, His156 en Ser?? is as die katalitiese drietal geïdentifiseer deur setelgerigte mutagenese. Dit is bevestig deur "n driedimensionele model van die ensiem te bou met die Bacillus subtilis lipase A as templaat. In "n poging om die promotorgebied van die Bacillus licheniformis te kloneer, is "n 3.5 kb DNA fragment verkry wat ltpolltiese aktiwiteit op tributirien agarplate getoon het. Nukleotied opeenvolgingsanalise van die gekloneerde fragment het "n nuwe karboksiel esterasegeen opgelewer met "n oop leesraam wat kodeer vir "n proteïen met 484 aminosure, "n geskatte molekulêre massa van 53 kDa en "n pi van 5.4. Hierdie studie het beduidend bygedra tot die beskikbare inligting aangaande die lipases van die Bacillus spesies. Alhoewel meer omtrent die molekulêre eienskappe van die Bacillus lipases bekend word, is daar min bekend oor die molekulêre meganismes wat die uitskeiding van die ensieme reguleer. Toekomstige navorsing behoort daarop gerig te wees om hierdie kwessie op te klaar. Dit sou die biogeniëring van Bacillus spesies fasiliteer en moontlik verhoogde uitskeidingsvlakke van die ensiem moontlik maak vir toepassing in die leer- of wasmiddelbedryf. Huidige studies wat gerig is om die promotorgedeelte van die lipase geen van Bacillus licheniformis te kloneer behoort daarom voortgesit te word. Die toepassing van Bacillus lipases in die biokatalitiese skeiding van rasemiese mengsels is nog nie volledig ondersoek nie. Die onlangse publikasie van die driedimensionele struktuur van 'n Familie 1.4 lipase maak nou meer sinvolle konstruksie van pasgemaakte Bacillus lipases moontlik. As voorbeeld kan genoem word dat die aminosuuropeenvolging van die volledig geprosesseerde lipase van Bacillus pumilis (UOFS) meer as 95% ooreenkoms toon met die ensiem van Bacillus licheniformis maar laasgenoemde toon 'n wyer optimale pH profiel. Die rede vir die verskillende pH profiel is nog onbekend. Die nuwe karboksiel esterasegeen wat gekloneer is behoort in groot maat uitgedruk te word en biochemies gekarakteriseer te word. Die biotegnologiese toepaslikheid van die ensiem kan dan ook bepaal word.
Afrikaans: Lipases (E.C. 3.1.1.3), wat wyd in die natuur voorkom, kataliseer die hidrolise van triasielgliserole. Die lipase-gekataliseerde reaksie is omkeerbaar en 'n wye verskeidenheid trans- en interesterifiseringreaksies is moontlik. Die ensieme kan die sintese van produkte wat nie gewoonweg deur konvensionele chemiese metodes gemaak kan word, nie moontlik maak, en daar kan verwag word dat, soos die toepaslikheid van ltpases meer bekend word, hulle steeds belangriker in die ensiem mark sal word. Daarom sal nuwe lipases met nuwe eienskappe benodig word. Bakteriese isolate wat hoofsaaklik van alkaliese melkery afloopwater versamel is, is op Rhodamien B/olyfolie-, Tween 80/CaC12- en tributirien-bevattende agarplate getoets. Isolate wat lipase vervaardig het, is in skudkulture vir lipase-produksie in die teenwoordigheid van verskillende koolstofbronne getoets. Bacillus licheniformis en Bacillus pumilus is as die beste lipase-produseerders geïdentifiseer met p-nitrofeniel palmitaat as toetssubstraat en deur relatiewe aktiwiteit, optimum pH en temperatuur as maatstaf te gebruik. Lipase produksie deur Bacillus licheniformis is ondersoek in die teenwoordigheid van verskillende koolhidrate en lipiedsubstrate. Die mikro-organisme kon nie groei in 'n mineraalmedium wat met Tween 20, Tween 80, kaproësuur of kaprillensuur gesupplementeer was nie. Dieselfde medium met tributirien, trioleïen, olyfolie, gliserol of glukose gesupplementeer is, kon groei ondersteun maar geen lipase aktiwiteit kon gemeet word nie, waarskynlik weens die gebrek aan 'n induksiefaktor. Dit het daarop gedui dat daar in 'n ryk voedingsop medium waarskynlik 'n lipase induseerder teenwoordig was. Die byvoeging van triasielgliserole, vrye vetsure, gliserol of glukose het die produksie van die ekstrasellulêre lipase onderdruk. Die onderdrukkende effek van triasielgliserole was vinniger en sterker as die van vetsure of gliserol afsonderlik, moontlik as gevolg van die gesamentlike effek van die twee verbindings wat beide die produkte van hidrolise is. Die waarnemings het gedui op 'n sinergistiese effek van moontlik twee afsonderlike bane waar deur vrye vetsure en gliserol die produksie van Bacillus licheniformis lipase onderdruk. Byvoeging van Tween 20 of Tween 80 het die produksie van lipases deur die organisme versterk en 'n toename tot so veel as 2000 eenhede/ml veroorsaak. Suiwering van die lipase is deur middel van 'n kombinasie van ioonuitruilings-, hidrofobiese interaksie-, hidroksielapatiet- en uitsluitingschromatografie was onsuksesvol. Aggregasie, 'n gebrek aan interaksie met die kolommedia of onomkeerbare binding van die lipase-proteïen aan die chromatografiemedium het die suiwering bemoeilik en slegs 'n gedeeltelik-gesuiwerde proteïen kon verkry word. Die lipasepreparaat het dieselfde eienskappe as dié van Bacillus pumi!is en Bacillus subti!is getoon. AI drie ensieme was termies labiel, kon alkali tolereer en het optimaal in alkaliese medium gefunksioneer. Die klonering en nukleotiedvolgordebepaling van die lipase geen van 'n Bacillus pumi!is isolaat het daarop gedui dat hierdie lipase en die een van Bacillus subti!is dieselfde struktuur kon hê. Dit kon daarop dui dat die lipase van Bacillus !icheniformis beduidende homologie met die ensiem van die ander twee bacilli kon toon. Degenererende voorlopers is, met die nukleotiedopeenvolging van die Bacillus pumi!is en Bacillus subti!is as basis, ontwerp. 'n DNA fragment van 560 basispare wat vir lipase aktiwiteit kodeer en met die genomiese DNA as templaat, is met die gebruik van die voorlopers geamplifiseer. Die DNA fragment wat vir die lipase kodeer is in 'n pET 20b(+) uitdrukkingsvektor gesubkloneer om 'n lipase konstruk te verkry met 6 histidienresidue aan die C-terminale van die proteïen toegevoeg. Hoë uitdrukkingsvlakke van die lipase is verkry met Escherichia coli selle wat die vektor bevat na induksie met IPTG by 30°C. 'n Enkel stap suiweringsprosedure deur chromatografie op Ni-NTA chromatografiemedium het gevolg. Die histidien merker kon verwyder word deur 'n 6X histidien volgorde aan die N-terminale punt van die proteïen te heg en dit na proteïenuitdrukking met rTEV protease te verwyder, Suiwering van die volledig geprosesseerde ensiem was daarna op die Ni-NTA kolom moontlik. Die ensiem met die C-terminale histidien merker sowel as die volledig geprosesseerde ensiem is daarna gekarakteriseer. Die gesuiwerde ensiem het 'n spesifieke aktiwiteit van 130 eenhede/mg getoon met p-nitrofeniel palmitaat as substraat. Die ensiem was maksimaal aktief by pH van 9.5-11 en was besonder stabiele by alkaliese pH tot by pH 12. Die Cterminale histidien merker het die lipase aktiwiteit by pH 10-11.5 versterk. Die ensiem was maksimaal aktief met p-nitrofeniel esters of triasielgliserole met C6 of Ca asielgroepe. Divalente Co, Zn, en Hg het die grootste effek op die aktiwiteit gehad; eersgenoemde twee het die aktiwiteit tot minder as 30% laat afneem terwyl Hg die ensiem totaal gedeaktiveer het. Die ensiem was nie deur EDTA, ditiotreïtol of merkaptoetanol geïnhibeer nie maar die klassieke serien proteaseinhibeerder, feniel-metiel-sulfonielfluoried (PMSF) (1mM) het die lipaseaktiwiteit tot minder as 40% van die kontrole laat afneem. Die aminosuuropeenvolging van die lipase het besondere ooreenkomste met lipases van Bacillus subtilis en Bacillus pumilis getoon. Met aminosuuropeenvolging en biologiese eienskappe as maatstaf is die Bacillus licheniformis lipase as 'n lid van die Familie 1.4 lipase geklassifiseer, saam met die lipases van Bacillus subtilis en Bacillus pumilis. Die konsensus-opeenvolging in die omgewing van die nukleofiliese serien het van die gewone Gly-X-Ser-X-Gly afgewyk. In die Bacillus lipases is die opeenvolging Ala-His-Ser-X-Gly, 'n motief wat ook in die groep groter lipases van die termofiele Bacillus spesies. Setelgerigte mutagenese van die Ala en His residue na-aan die nukleofiliese Ser het aangedui dat die lipase-ensieme dié aminosure verkry het, waarskynlik tydens evolusie vir optimale aktiwiteit en verhoogde termiese stabiliteit. Asp133, His156 en Ser?? is as die katalitiese drietal geïdentifiseer deur setelgerigte mutagenese. Dit is bevestig deur "n driedimensionele model van die ensiem te bou met die Bacillus subtilis lipase A as templaat. In "n poging om die promotorgebied van die Bacillus licheniformis te kloneer, is "n 3.5 kb DNA fragment verkry wat ltpolltiese aktiwiteit op tributirien agarplate getoon het. Nukleotied opeenvolgingsanalise van die gekloneerde fragment het "n nuwe karboksiel esterasegeen opgelewer met "n oop leesraam wat kodeer vir "n proteïen met 484 aminosure, "n geskatte molekulêre massa van 53 kDa en "n pi van 5.4. Hierdie studie het beduidend bygedra tot die beskikbare inligting aangaande die lipases van die Bacillus spesies. Alhoewel meer omtrent die molekulêre eienskappe van die Bacillus lipases bekend word, is daar min bekend oor die molekulêre meganismes wat die uitskeiding van die ensieme reguleer. Toekomstige navorsing behoort daarop gerig te wees om hierdie kwessie op te klaar. Dit sou die biogeniëring van Bacillus spesies fasiliteer en moontlik verhoogde uitskeidingsvlakke van die ensiem moontlik maak vir toepassing in die leer- of wasmiddelbedryf. Huidige studies wat gerig is om die promotorgedeelte van die lipase geen van Bacillus licheniformis te kloneer behoort daarom voortgesit te word. Die toepassing van Bacillus lipases in die biokatalitiese skeiding van rasemiese mengsels is nog nie volledig ondersoek nie. Die onlangse publikasie van die driedimensionele struktuur van 'n Familie 1.4 lipase maak nou meer sinvolle konstruksie van pasgemaakte Bacillus lipases moontlik. As voorbeeld kan genoem word dat die aminosuuropeenvolging van die volledig geprosesseerde lipase van Bacillus pumilis (UOFS) meer as 95% ooreenkoms toon met die ensiem van Bacillus licheniformis maar laasgenoemde toon 'n wyer optimale pH profiel. Die rede vir die verskillende pH profiel is nog onbekend. Die nuwe karboksiel esterasegeen wat gekloneer is behoort in groot maat uitgedruk te word en biochemies gekarakteriseer te word. Die biotegnologiese toepaslikheid van die ensiem kan dan ook bepaal word.
Description
Keywords
Bacillus (Bacteria), Lipase, Enzymes -- Analysis, Thesis (Ph.D. (Microbiology and Biochemistry))--University of the Free State, 2001