Cloning of the XynA gene from Thermomyces lanuginosus and expression in Saccharomyces cerevisiae
Loading...
Files
Date
2001-11
Authors
Nel, Sanet
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: The xylanase from Thermomyces lanuginosus (XynA) was cloned into two
shuttle vectors, pRS416 (single copy vector) and pRS426 (multi-copy vector)
adjacent to a PDC1 promoter (designated pRS416:XynA and pRS426:XynA). An
expression cassette for this xylanase was constructed by cloning of the XynA
gene into a modified a-agglutinin (Aga1) gene from Saccharomyces cerevisiae.
This modification entailed the deletion of the binding domain coding region of the
Aga1, and the cloning of the XynA gene into this deleted binding domain region,
which is flanked by a stalk-like protein coding region. This fusion protein was
cloned into two shuttle vectors (pRS416 and pRS426), flanking the PDC1
promoter (designated pRS416:Aga1::XynA and pRS426:Aga1::XynA). The aim
of the cassette was to immobilize the expressed enzyme on the cell surface of
the yeast cell with the expression of the xylanase on the stalk of the Aga1,
however, extracellular secretion of the enzyme was obtained upon expression.
Enzyme assays performed on pRS416:XynA and pRS426:XynA yielded very low
activity [0.1505 U/ml (2.5088 nKat/ml) and 0.0909 U/ml (1.5153 nKat/ml)
respectively], whereas pRS416:Aga1::XynA and pRS426:Aga1::XynA yielded
activities of 1.7035 U/ml (28.3973 nKat/ml) and 1.7319 U/ml (28.8707 nKat/ml)
respectively. The partial characterization of this extracellular secreted
recombinant xylanase (pRS416:Aga1::XynA and pRS426:Aga1::XynA) yielded an optimum temperature of 70 °C and an optimum pH of 6.0-7.0. Thermal
stability for the recombinant xylanase was determined for temperatures 50 °C, 60
°C and 70 °C, and the activation energy for pRS416:Aga1::XynA and
pRS426:Aga1::XynA were calculated as 34.86 kJ/mol and 53.59 kJ/mol
respectively.
Afrikaans: Die doel van die studie was die konstruksie van ‘n geï mobiliseerde sel oppervlak uitdrukkingskasset vir die xilanase (XynA) van Thermomyces lanuginosus. Hierdie kasset is gemaak deur die verwydering van die bindingsdomein koderings gebied van ‘n a-agglutinasie geen (Aga1) van Saccharomyces cerevisiae, en die klonering van die XynA geen in hierdie gebied, wat aangrensend is aan ‘n steelagtige proteien koderingsgebied. Die motivering hiervoor was dat die ensiem op hierdie steel uitgedruk kan word, op die oppervlak van die gis-selwand, and so n geï mobiliseerde ensiemsisteem kan skep. Totale RNS van T. lanuginosus is geï soleer, en die XynA geen geamplifiseer met ‘n twee-stap omgekeerde transkripsie polimerase ketting reaksie met spesifieke inleiers. Hierdie geamplifiseerde XynA is suksesvol gekloneer en basispaar opeenvolging orde bepaal. ‘n PDC1 promotor van S. cerevisiae is kloneer in twee oordragingsvektore, pRS416 (enkel kopie) en pRS426 (multikopie). Hierdie gemodifiseerde Aga1 (met die XynA gekloon in the verwyderde bindingsgebied), is gekloneer in die twee oordragingsvektore, langs die PDC1 promoter, en getransformeer na S. cerevisiae. Na uitdrukking was dit duidelik dat die ensiem nie geï mobiliseer is nie, want geen aktiwiteit is verkry nadat ensiem aktiwiteitsbepalings op die heel selle uitgevoer is nie. Aktiwiteit is wel gekry in die ekstrasellulêre fraksie, wat wys dat die ensiem ekstrasellulêr uitgeskei is. Verdere ensiem aktiwiteitsbepalings is uitgevoer op die ekstrasellulêre fraksie as ru-ensiem ekstrak om die gedeeltelike karakterisering van die uitgeskeide ensiem te voltooi. 101 Chapter 7 - Opsomming Die optimum temperatuur van die uitgedrukte ensiem is bepaal as 70 °C, en optimum pH was 6.0-7.0. Dit is gelykstaande aan waardes wat in literatuur gebubliseer is. Die totale aktiwiteit van die rekombinanate xilanase is egter laer as die van gepubliseerde data. Die temperatuur stabiliteit van die rekombinante xilanase is ook nie vergelykbaar met gepubliseerde data nie. Dit wil egter voorkom of the Aga1-konstruk ‘n mate van stabiliteit aan die uitgedrukte ensiem verskaf, want min of geen aktiwiteit is gevind met die xilanase uitgedruk in S. cerevisiae sonder die konstruk nie. Verdere ondersoeke na die redes waarom min aktiwiteit en stabiliteit verkry is en geen immobilisering met uitdrukking van die ensiem in die uitdrukkingskasette nie, kan waardevol wees in die soeke na ‘n geï mobiliseerde seloppervlak uitdrukkingssisteem in S. cerevisiae.
Afrikaans: Die doel van die studie was die konstruksie van ‘n geï mobiliseerde sel oppervlak uitdrukkingskasset vir die xilanase (XynA) van Thermomyces lanuginosus. Hierdie kasset is gemaak deur die verwydering van die bindingsdomein koderings gebied van ‘n a-agglutinasie geen (Aga1) van Saccharomyces cerevisiae, en die klonering van die XynA geen in hierdie gebied, wat aangrensend is aan ‘n steelagtige proteien koderingsgebied. Die motivering hiervoor was dat die ensiem op hierdie steel uitgedruk kan word, op die oppervlak van die gis-selwand, and so n geï mobiliseerde ensiemsisteem kan skep. Totale RNS van T. lanuginosus is geï soleer, en die XynA geen geamplifiseer met ‘n twee-stap omgekeerde transkripsie polimerase ketting reaksie met spesifieke inleiers. Hierdie geamplifiseerde XynA is suksesvol gekloneer en basispaar opeenvolging orde bepaal. ‘n PDC1 promotor van S. cerevisiae is kloneer in twee oordragingsvektore, pRS416 (enkel kopie) en pRS426 (multikopie). Hierdie gemodifiseerde Aga1 (met die XynA gekloon in the verwyderde bindingsgebied), is gekloneer in die twee oordragingsvektore, langs die PDC1 promoter, en getransformeer na S. cerevisiae. Na uitdrukking was dit duidelik dat die ensiem nie geï mobiliseer is nie, want geen aktiwiteit is verkry nadat ensiem aktiwiteitsbepalings op die heel selle uitgevoer is nie. Aktiwiteit is wel gekry in die ekstrasellulêre fraksie, wat wys dat die ensiem ekstrasellulêr uitgeskei is. Verdere ensiem aktiwiteitsbepalings is uitgevoer op die ekstrasellulêre fraksie as ru-ensiem ekstrak om die gedeeltelike karakterisering van die uitgeskeide ensiem te voltooi. 101 Chapter 7 - Opsomming Die optimum temperatuur van die uitgedrukte ensiem is bepaal as 70 °C, en optimum pH was 6.0-7.0. Dit is gelykstaande aan waardes wat in literatuur gebubliseer is. Die totale aktiwiteit van die rekombinanate xilanase is egter laer as die van gepubliseerde data. Die temperatuur stabiliteit van die rekombinante xilanase is ook nie vergelykbaar met gepubliseerde data nie. Dit wil egter voorkom of the Aga1-konstruk ‘n mate van stabiliteit aan die uitgedrukte ensiem verskaf, want min of geen aktiwiteit is gevind met die xilanase uitgedruk in S. cerevisiae sonder die konstruk nie. Verdere ondersoeke na die redes waarom min aktiwiteit en stabiliteit verkry is en geen immobilisering met uitdrukking van die ensiem in die uitdrukkingskasette nie, kan waardevol wees in die soeke na ‘n geï mobiliseerde seloppervlak uitdrukkingssisteem in S. cerevisiae.
Description
Keywords
Molecular cloning, Xylanases -- Biotechnology, Enzymes, Cloning, Saccharomyces cerevisiae, Expression, Thermomyces lanuginosus, Xyna gene, Dissertation (M.Sc. (Microbiology and Biochemistry)--University of the Free State, 2002