Bragg, R. R.Mathengtheng, Lehlohonolo2015-11-122015-11-122007-112007-112007-11http://hdl.handle.net/11660/1625English: Mycoplasma gallisepticum is the most pathogenic avian Mycoplasma species and leads to great economic losses worldwide (Kleven, 2003). Prevention and control of this organism has been achieved by vaccination and antibiotic administration. Ferraz and Danelli (2003) reported on the most widely used live vaccines which are MG-F, Ts-11 and 6/85. The MG-F strain is currently not registered for use in South Africa. M. imitans is the most closely related organism to M. gallisepticum and was tentatively identified as M. gallisepticum until Bradbury and co-workers (1993) defined it as a different species. However, this species is still misidentified as M. gallisepticum due to serological cross-reactivity and M. gallisepticum specific primers also detecting M. imitans (Markham et al., 1999). While M. gallisepticum has been characterized in some countries, very little information is documented on the South African isolates. It therefore became the aim of this study to investigate the presence and diversity of this organism in Southern Africa, investigate the presence of M. imitans as well as to establish the relatedness of the Southern African strains to those isolated outside Africa. Samples were collected from serologically positive birds from different farms in South Africa and Zimbabwe. Two PCR (Polymerase Chain Reaction) assays were optimized, one to detect M. gallisepticum of a specific gene Mgc2, the other to detect both M. gallisepticum and M. imitans. A total of five samples were detected with the Mgc2-PCR, while almost all samples could be detected with the 16S rRNA gene-PCR. This is a possible indication of a different M. gallisepticum isolate that can be detected on the 16S rRNA gene level but not at the Mgc2 level, or the isolate could indeed be M. imitans. In a study by Woese and co-workers (1985), the Mgc2 gene was implicated as one of the rapidly mutating genes due to adaptation, a possible reason for the non- detection of Mgc2 but the detection of the 16S rRNA gene. Of the sequenced 16S rRNA gene-PCR amplicons, M. gallisepticum and M. imitans had the highest homology. However, there are only two complete sequences of the 16S rRNA genes that belong to two M. gallisepticum strains deposited in Genbank, thus limiting the information on the isolates detected. Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLPs) were performed and well optimized. Ts-11 gave the expected profile while tested samples could not be placed in any of the reference groups. It was observed, however, that the RFLP profile of one of the amplicons was similar to the 6/85 vaccine strain and subsequent results correlated with this finding. Two of the amplicons could be sequenced and further analyzed. A phylogenetic tree showed one of the amplicons clustering away from the other Mycoplasma species though its sequence was found to be that of M. gallisepticum or M. imitans. In another tree, one of the amplicons showed more homology to the pathogenic strains while the other showed more homology to the vaccine strain 6/85. The DGGE analyses showed that the amplicons consist of a mixed template which was the reason why some samples could not be properly sequenced. This might be an indication of mixed infection within the flocks. However, it was expected of the 16S rRNA to give these results. Furthermore, the DGGE results indicated that the vaccine strain Ts-11 is used to vaccinate some of the flocks, while other flocks are infected with wild-type Mycoplasma. The results also suggest the possibility of the presence of two copies of the amplified region of the 16S rRNA gene in this vaccine strain. The study has confirmed the presence of M. gallisepticum and the possible presence of M. imitans. Different yet closely related Mycoplasma isolates are also present in South Africa. These could represent novel strains or species and warrant further investigation.Afrikaans: Mycoplasma gallisepticum is die mees patogeniese voël Mycoplasma spesie en ly tot groot ekonomiese verliese wêreldwyd (Kleven, 2003). Voorkoming en beheer van hierdie organisme is bewerkstellig deur vaksinasie. MG-F, Ts-11 en 9/85 is volgens Ferraz en Danelli (2003) die mees gebruikte lewendige entstowwe. Die MG-F stam is tans nie geregistreer vir gebruik in Suid Afrika nie. M. imitans is die naaste verwant aan M. gallisepticum en was eksperimenteel geïdentifiseer as M. gallisepticum totdat Bradbury en medewerkers (1993) dit as ʼn verskillende spesie geïdentifiseer het. Hierdie spesie word egter nog steeds verkeerdelik geïdentifiseer as M. gallisepticum as gevolg van serologiese kruisreaktiwiteit en omdat die M. gallisepticum spesifieke voorvoerders ook M. imitans identifiseer (Markham et al., 1999). M. gallisepticum is al geïdentifiseer in sommige lande, maar baie min inligting is beskikbaar oor die voorkoms van hierdie organisme in Suid-Afrika. Dit het gevolglik die doel van hierdie studie geword om die teenwoordigheid en diversiteit van die organismes in Suider-Afrika te ondersoek, die teenwoordigheid van M. imitans in Suid-Afrika te ondersoek asook om die verwantskap van die Suider-Afrikaanse spesies met die wat buite Afrika geïsoleer is, te bepaal. Monsters is versamel van serologies positiewe voëls vanaf verskillende plase in Suid-Afrika en Zimbabwe. Twee PKR reaksies was gestandaardiseer, een om die M. gallisepticum deur middel van amplifikasie van die Mgc2 geen te identifiseer en ʼn tweede PKR reaksie om M. gallisepticum en M. initans te identifiseer. ʼn Totaal van vyf monsters is positief geïdentifiseer deur middel van die Mgc2-PKR terwyl die meeste geïdentifiseer was met die 16S rRNA-PKR. Hierdie is ʼn mootlike aanduiding dat ʼn verskillende M. gallisepticum isolaat geïdentifiseer is op die vlak van die 16S rRNA maar nie op die vlak van die Mgc2 geen nie. Die moontlikheid bestaan egter wel dat hierdie isolaat wel M. imitans kan wees. In ʼn studie van Woese en medewerkers (1985) was die Mgc2 geen uitgewys as een van die vinnigste muterende gene as gevolg van aanpassing en mag dalk nog ʼn rede wees waarom identifikasie deur gebruik te maak van die Mgc2 geen onsuksesvol was. Homologie van die basisopeenvolgings van die 16S rRNA PKR produkte was die hoogste tussen M. gallisepticum en M. imitans. Daar is egter slegs twee volledige basisopeenvolgings van die 16S rRNA geen beskikbaar op die Genbank databasis wat behoort aan twee stamme van M. gallisepticum wat inligting oor die isolate beperk. Restriksie Fragment Lengte Polimorfisme (RFLP) analises is uitgevoer en gestandaardiseer. Die verwagte profiel is verkry met Ts-11 maar die ander monsters wat getoets is kon in geen verwysings groep geplaas word nie. Resultate het egter gewys dat een van die PKR produkte ʼn RFLP profiel gehad het soortgelyk aan die van die 6/85 entstof, verdere analise het hierdie resultaat bevestig. Die basispaaropeenvolging van twee van die PKR produkte is bepaal en verder geanaliseer. Filogenetiese analise het gewys dat een van die PKR produkte groepeer weg vanaf die ander Mycoplasma isolate alhoewel die basispaaropeenvolging aandui dat dit wel M. gallisepticum of M. imitans is. In ʼn ander filogenetiese boom toon een van die PKR produkte homologie teenoor die patogeniese stamme terwyl die ander homologie tot die entstof stam 6/85 toon. DGJE analise het aangetoon dat die PKR produkte uit ʼn gemengde populasie bestaan het en dit kan die mootlike rede wees waarom die basisopeenvolging van hierdie monsters nie bepaal kon word nie. Dit kan dalk ook beteken dat daar ʼn gemengde infeksie was in die voëls. Dit was egter verwag dat 16S rRNS resultate hierop moes gewys het. Volgens DGJE analise is die entstof stam Ts-11 gebruik om sommige van die voëls in te ent terwyl ander met die wilde tipe Mycoplasma geïnfekteer was. Die resultate dui ook tot die moontlike teenwoordigheid van twee kopieë van die geamplifiseerde deel van die 16S rRNA geen in die entstof stam. Hierdie studie het die teenwoordigheid van M. gallisepticum en die moontlike teenwoordigheid van M. imitans bevestig. Verskillende, maar naby verwante Mycoplasma isolate, is ook teenwoordig in Suid-Afrika. Hierdie kan unieke stamme of spesies verteenwoordig en regverdig verdere ondersoek om dit te bevestig.enDissertation (M.Sc. (Microbial, Biochemical and Food Biotechnology))--University of the Free State, 2007Poultry -- DiseasesMycoplasma gallisepticumDenaturing Gradient Gel ElectrophoresisMgc2Mycoplasma gallisepticumMycoplasma gallisepticumPolymerase Chain ReactionRestriction Fragment Length PolymeraseSouth AfricaDissertationUniversity of the Free State