A kinetic and molecular study of the lipase from Geobacillus thermoleovorans GE-7
Loading...
Date
2005-06
Authors
Barnard, Tobias George
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: Geobacillus thermoleovorans GE-7 was isolated from the West-Driefontein goldmine in South Africa. It is a Gram positive rod showing optimal growth at 65°C. Lipase production by the organism cna be induced using tributyrin, Tween 80 and stearic acid. We were able to partially purify this thermophilic lipase (native lipase) using hydrophobic (Phenyl-Toyopearl), anionic (Super-Q and DEAE-Toyoperal) and size exclusion (Sephacryl S-100/200-HR) chromatographic resins. Using triburyrin zymograms, the size of the protein was estimated to be 40 kDa with a pl of 7. The lipase open reading frame (1251 bp), coding for the signal peptide and mature lipase, could be successfully amplified from genomic DNA using polymerase chain reaction and the PCR product was cloned into the pGEM®T-easy cloning vector (pGEMGtherm-LipA; LipA). The gene was modified with PCR and cloned into the pET 28a expression vector to yield a hexa histidine tag at the C-(pETGtherm-LipA(C)) and N-therminus (pETGtherm-LipA(N)) of the lipase gene. All three clones could be successfully expressed in E. coli JM109(DE3), with expression levels of the N-tagged lipase 23.4 times higher when compared to optimised lipase production by G. thermoleovorans GE-7. The N-tagged and C-tagged lipase could be successfully purified using affinity chromatography (Ni-NTA resin) whilst the LipA lipase was only partially purified using the same purification protocols used for the native lipase. The N-terminal His6 tag was removed using thrombin targeting the incorporated thrombin cleavage site, resulting in the Detagged lipase which could be separated from the cleaved His6 tag using the Ni-NTA resin. The N- and Detagged lipase was stable during storage but the C-tagged lipase has to be stored in with 1 mM CaCl2 and 1 mM ZnSO4 to retain activity. The different lipase sizes and pl's were comparable, ranging from 42 kDa (pl 7.3) for the C-tagged lipase, 41.1 kDa (pl 7.1) for the N-tagged lipase, 39 kDa (pl 6.8) for the Detagged lipase and 41 kDa for LipA. The optimum temperatures for the lipases varied from 55°C (C-tagged) to 60°C (N-tagged, Detagged, native, LipA) but could be increased to 65°C with the addition of 1mM CaCl2 (Detagged and N-tagged lipase). All the lipases showed an optimum pH of 9-10 and had a preference for the shorter chain saturated for the shorter chain saturated fatty acids. In the presence of 1 mM CaCl2 the N-tagged lipase had a half-life of 1 h at 70°C and 23 h at 65°C while the Detagged lipase had a half-life of 19 min at 70°C and 2.7 h at 65°C. The C-tagged lipase had a half-life of only 2 min at this temperature. Initial interest was in the production of a lipase by an extremophillic bacterium, but addition of the N-terminal histidine tag also lead to a higher enzyme stability at higher temperatures. The activity of the C-. N- and Detagged lipase was enhanced by te presence of Triton X-100 and CHAPS, but was inhibited by SDS and cetrimide, and were stable in up to 20% (v/v) of various alcohols. Ca2+, M2+, and Mn2+ (up to 5 mM) enhanced the activity of the C- and N-tagged lipase but slightly inhibited the Detagged lipase. All three enzymes showed slight inhibition in the presence of Zn2+ but was inhibited by Al2+ and Hg2+. EDTA had an inhibitory effect on lipase activity, but TPEN showed no effect. The N-tagged and Detagged lipases showed preference for sn-1,3-dicaprin isomer with monolayer experiments but did not exhibit any phospho- or galactolipase activity.
Afrikaans: Geobacillus thermoleovorans GE-7 is uit die Wes-Driefontein-goudmyn in Suid-Afrika geïsoloeer. Dit in 'n Gram-negatiewe staff met 'n optimale groeitemperatuur van 65°C. Lipase-produksie deur die organisme kon met tributirien, Tween 80 en steariensuur geïnduseer word. Ons kon daarin slaag om die termofiliese (natuurlike) lipase gedeeltelik te suiwer deur van hidrofobiese- (Phenyl-Toyopearl), anioniese- (Super-Q en DEAE-Toyopearl) en uitsluitings- (sephacryl S-100/200-HR) chromatorafiemedia gebruik te maak. Deur van tributirien simogramme gebruik te maak, kon die grootte van die proteïen op ongeveer 40 kDa geskat word met 'n pl van 7. Die oopleesraam (251 bp) wat vir die seinpeptied sowel as die geprossesseerde lipase koder, kon suksesvol vaaf die genomiese DNA deur middel van die polimerase kettingreaksie geamplifiseer word. Die PKR-produk is in die pGEM®T-easy kloneringsvektor ingevoeg (pGEMGtherm-LipA; LipA). die geen is ook gemodifiseer deur 'n PKR reaksietegniek te gebruik en in die pET 28a uitdrukkingsvektor ingevoeg, om die heksa-histidien aan die C-(pETGtherm-LipA(C)) sowel as die N-terminale (pETGtherm-LipA(N)) punt van die ensiem op te lewer. Al drie klone kon suksesvol uitgedruk word in E. coli JM109(DE3). Uitdrukkingsvlakke van die N-gekopelde lipase was 23.4 keer hoër as die van die geoptimeerde vlakke behaal met die Geobacillus GE-7 self. Die N-gemerkte en C-gemerkte lipase kon gesuiwer word deur van affiniteitschromatografie met 'n Ni-NTA chromatografiemdium gebruik te maak. Die LipA kon net gedeeltelik gesuiwer word deur van dieselfde suiweringsprosedure as vir die natuurlike lipase gebruik te maak. Die N-terminale His6 merkstuk kon verwyder word deur trombien vertering, gerig op die geïnkorporeerde kliewingsetel, gevolg deur Ni-NTA affiniteitschromatografie. Die N-gemerkte lipase ne die een waarvan die koppelstuk verwyder is, was stabiel tydens berging maar die C-gemerkte ensiem moes in die teenwoordigheid van 1 mM CaCl2 en 1 mM ZnSO4 geberg word om aktiwiteit te behou. Die groottes en pl-waardes van die verskillende lipases was vergelykbaar en het tussen 42 kDa (pl 7.3) vir die C-gemerkte, 41.1 kDa (pl 7.1) vir die N-gemerkte, 39 kDa (pl 6.8) vir die nsiem waarvan die N-terminale koppelstuk verwyder is en 41 kDa vir LipA gewissel. Die optimum temperature vir die lipases het tussen 55°C (C-gemerkte) en 60°C (N-gemerkte, N-terminale merkstuk verwyder, natuurlik, LipA), gewissel maar kon tot 65°C verhoog word met die byvoeging van 1 mM CaCl2 (N-terminale merkstuk verwyder en N-gemerkte lipase). Al die lipases het 'n optimum pH van 9-10 vertoon en het kortketting, versadigde vetsuuresters verkies. In die teenwoordigheid vna CaCl2, het die N-gemerkte ensiem 'n halfleeftyd van 1 h by 70°C en 23 h by 65°C getoon terwyl die ensiem waarvan die N-terminale merkstuk verwyder is 'n halfleeftyd van 19 min by 70°C en 2.7 h by 65°C getoon het. Die aktiwiteit van die gemerkte ensim sowel as die waarvan die merkstuk verwyder is, is verhoog deur Triton X-100 en CHAPS maar dit is deur SDS en setramied geïnhibeer. Die ensiem was stabiel in die teenwoordigheid van 20% (v/v) van verskillende alkohole. Ca2+, Mg2+, en Mn2+ (tot 5 mM) het die aktiwiteit van die N- en C-gemerkte ensieme verhoog maar het die ensiem waarvan die merkstuk verwyder is, matig geïnhibeer. Al drie ensieme is matig deur Zn2+ en sterk deur Al2+ en Hg2+ geïnhibeer. EDTA het die ensiem geïnhibeer maar TPEN het geen effek getoon nie. Beide die N-gemerkte en die ensiem waarvan die merkstuk verwyder is, het voorkeur getoon vir die sn-1.3-posisie met dikaprien isomere as substraat, in lipied-monolaag eksperimente. Die ensiemen het nie fosfolipase- of galaktolipase-aktiwiteit getoon nie.
Afrikaans: Geobacillus thermoleovorans GE-7 is uit die Wes-Driefontein-goudmyn in Suid-Afrika geïsoloeer. Dit in 'n Gram-negatiewe staff met 'n optimale groeitemperatuur van 65°C. Lipase-produksie deur die organisme kon met tributirien, Tween 80 en steariensuur geïnduseer word. Ons kon daarin slaag om die termofiliese (natuurlike) lipase gedeeltelik te suiwer deur van hidrofobiese- (Phenyl-Toyopearl), anioniese- (Super-Q en DEAE-Toyopearl) en uitsluitings- (sephacryl S-100/200-HR) chromatorafiemedia gebruik te maak. Deur van tributirien simogramme gebruik te maak, kon die grootte van die proteïen op ongeveer 40 kDa geskat word met 'n pl van 7. Die oopleesraam (251 bp) wat vir die seinpeptied sowel as die geprossesseerde lipase koder, kon suksesvol vaaf die genomiese DNA deur middel van die polimerase kettingreaksie geamplifiseer word. Die PKR-produk is in die pGEM®T-easy kloneringsvektor ingevoeg (pGEMGtherm-LipA; LipA). die geen is ook gemodifiseer deur 'n PKR reaksietegniek te gebruik en in die pET 28a uitdrukkingsvektor ingevoeg, om die heksa-histidien aan die C-(pETGtherm-LipA(C)) sowel as die N-terminale (pETGtherm-LipA(N)) punt van die ensiem op te lewer. Al drie klone kon suksesvol uitgedruk word in E. coli JM109(DE3). Uitdrukkingsvlakke van die N-gekopelde lipase was 23.4 keer hoër as die van die geoptimeerde vlakke behaal met die Geobacillus GE-7 self. Die N-gemerkte en C-gemerkte lipase kon gesuiwer word deur van affiniteitschromatografie met 'n Ni-NTA chromatografiemdium gebruik te maak. Die LipA kon net gedeeltelik gesuiwer word deur van dieselfde suiweringsprosedure as vir die natuurlike lipase gebruik te maak. Die N-terminale His6 merkstuk kon verwyder word deur trombien vertering, gerig op die geïnkorporeerde kliewingsetel, gevolg deur Ni-NTA affiniteitschromatografie. Die N-gemerkte lipase ne die een waarvan die koppelstuk verwyder is, was stabiel tydens berging maar die C-gemerkte ensiem moes in die teenwoordigheid van 1 mM CaCl2 en 1 mM ZnSO4 geberg word om aktiwiteit te behou. Die groottes en pl-waardes van die verskillende lipases was vergelykbaar en het tussen 42 kDa (pl 7.3) vir die C-gemerkte, 41.1 kDa (pl 7.1) vir die N-gemerkte, 39 kDa (pl 6.8) vir die nsiem waarvan die N-terminale koppelstuk verwyder is en 41 kDa vir LipA gewissel. Die optimum temperature vir die lipases het tussen 55°C (C-gemerkte) en 60°C (N-gemerkte, N-terminale merkstuk verwyder, natuurlik, LipA), gewissel maar kon tot 65°C verhoog word met die byvoeging van 1 mM CaCl2 (N-terminale merkstuk verwyder en N-gemerkte lipase). Al die lipases het 'n optimum pH van 9-10 vertoon en het kortketting, versadigde vetsuuresters verkies. In die teenwoordigheid vna CaCl2, het die N-gemerkte ensiem 'n halfleeftyd van 1 h by 70°C en 23 h by 65°C getoon terwyl die ensiem waarvan die N-terminale merkstuk verwyder is 'n halfleeftyd van 19 min by 70°C en 2.7 h by 65°C getoon het. Die aktiwiteit van die gemerkte ensim sowel as die waarvan die merkstuk verwyder is, is verhoog deur Triton X-100 en CHAPS maar dit is deur SDS en setramied geïnhibeer. Die ensiem was stabiel in die teenwoordigheid van 20% (v/v) van verskillende alkohole. Ca2+, Mg2+, en Mn2+ (tot 5 mM) het die aktiwiteit van die N- en C-gemerkte ensieme verhoog maar het die ensiem waarvan die merkstuk verwyder is, matig geïnhibeer. Al drie ensieme is matig deur Zn2+ en sterk deur Al2+ en Hg2+ geïnhibeer. EDTA het die ensiem geïnhibeer maar TPEN het geen effek getoon nie. Beide die N-gemerkte en die ensiem waarvan die merkstuk verwyder is, het voorkeur getoon vir die sn-1.3-posisie met dikaprien isomere as substraat, in lipied-monolaag eksperimente. Die ensiemen het nie fosfolipase- of galaktolipase-aktiwiteit getoon nie.
Description
Keywords
Thesis (Ph.D. (Biotechnolgoy))--University of the Free State, 2005, Thermophilic bacteria, Lipase, Enzymes