Production of laccase by the white-rot fungus Pycnoporus sanguineus
Loading...
Date
2002-05
Authors
Van der Merwe, Johannes Jacobus
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
University of the Free State
Abstract
English: White-rot fungi and their enzymes are receiving increasing attention for biotechnological applications in the pulp and paper industry as alternatives to conventional bleaching. Laccase has been identified as one of the enzymes that plays a major role in lignin degradation. Laccase only attacks phenolic subunits of lignin, but its substrate range can be extended to non-phenolic subunits by the inclusion of a mediator. The use of this enzyme was, therefore, not successful in pulp bleaching trials until the discovery of mediators. Although the existence of natural mediators has not been confirmed, various components have been identified that are able to act as mediators. Improved methods of laccase production could benefit the industrial utilisation of the enzyme. White-rot fungi constitutively produce low concentrations of laccase, but higher concentrations can be obtained with the inclusion of inducers in the cultivation media. The enzyme is mainly produced during the stationary growth phase of the fungi, but various factors such as glucose, nitrogen and pH can influence levels of laccase production. The enzyme does not only hold potential for biological pulp bleaching operations, but also has application in bioremediation, the textile dye industry as well as the food and beverage industries.
Afrikaans: Talle pogings is reeds aangewend om ensieme vir die afbreking van lignien in papierpulp te gebruik. Een ensiem wat bekend is vir die belangrike rol wat dit in die afbreking van lignien speel, is lakkase (EC 1.10.3.2; benseendiol:suurstof oksidoreduktase). Lakkase kan moontlik aangewend word in biobleikprosesse deur middel van die lakkase-mediatorstelsel. Witvrotfungi is welbekende produseerders van lakkase, maar daar is min bekend oor die kweking van hierdie fungi in vloeistofkultuur. Dit is, daarom, noodsaaklik om die uitwerking van verskillende parameters op lakkase en biomassaproduksie deur hierdie fungi vas te stel, wanneer hulle in vloeistofkultuur gekweek word. Die doel van hierdie studie was eerstens om fungus isolate te kies wat in staat is om hoë konsentrasie van hittestabiele lakkase te produseer en tweedens om die toestande vir die vervaardiging van lakkase te optimaliseer. Derdens was die doel om die kinetika vir die groei van en lakkasevervaardiging deur Pycnoporus sanguineus (L.:Fr.) Murr. (SCC 108) vas te stel. Die vermoë van die meeste fungi in ons kultuurversameling om lignienafbrekende ensieme te vervaardig, is voorheen bepaal. Hierdie resultate was egter kwalitatief en die aktiwiteit en hoeveelheid lakkases wat deur hierdie fungi vervaardig is, moes bepaal word. Isolate wat lakkase vervaardig sowel as verwysingsisolate en negatiewe kontroles is by die kwantitatiewe siftingseksperimente ingesluit om hiperproduserende isolate te identifiseer. Ensiemaktiwiteit is spektrofotometries bepaal deur van 2,2’ –azinobis (3- etielbenstiazolien-6-sulfonaat) as substraat gebruik te maak. Sestien isolate en ‘n verwysingsisolaat, Coriolus versicolor (Wulf.:Fr.) Quél. (ATCC 20869) is gekies om die hittestabiliteit en optimale temperature van die lakkase verder te evalueer. Sommige van die lakkases in die rou ekstrak het stabiliteit by temperature so hoog soos 65 °C vertoon. By 75 °C het die lakkase van P. sanguineus (SCC 108), P. sanguineus (SCC 207) en die ongeidentifiseerde isolaat (SCC 260) half-leeftye van meer as 30 min. vertoon. Molasse was ‘n geskikte medium vir die kweking van P. sanguineus en die vervaardiging van lakkase aangesien ‘n hoë vlak van lakkase-aktiwiteit en biomassa in skudflesse verkry is met 4 % molasse, selfs sonder enige voorafbehandeling. Molasse het bestandele bevat wat verhoogde lakkasevervaardiging tot gevolg gehad het indien dit met minerale soutmedia met gelykstaande hoeveelhede voedingstowwe vergelyk word. Molasse kon as ‘n lae koste koolstofvoedingsbron vir die kweek van P. sanguineus beskou word, maar daar was ‘n tekort aan sommige aanvullings vir optimale lakkasevervaardiging. Verhoogde lakkase-aktiwiteit is verkry deur die insluiting van sekere xenobiotiese bestanddele in beide die molasse en ‘n mineralesout medium. Hoë koolstof- tot stikstofverhoudings het die produksie van lakkase verhoog. Toe die fungus in ‘n 15-l bioreaktor gekweek is, is die stasionêre groeifase daarvan na meer as 60 h se kweking bereik. Lakkase-aktiwiteit het na 48 h vermeerder, wat aandui dat lakkasevervaardiging in die eksponensiële groeifase begin het en in die stasionêre fase voortgegaan het. Die kweking van P. sanguineus in ‘n mineralesout medium met 16 mM veratriel alkohol sonder pH-beheer en ‘n opgeloste suurstofspanning van 40 %, het die hoogste lakkasevervaardiging (8,13 Eenhede.ml-1) tot gevolg gehad. Daar is aanduidings dat lae pH vlakke lakkase produksie aktiveer. Hierdie studie van die kweking van P. sanguineus het bygedra tot ons kennis van die fisiologie en lakkasevervaardiging deur witvrotfungi. Hierdie resultate sou in industriële prosesse vir die vervaardiging van lakkase toegepas kon word en mag ook van toepassing wees by die lakkasevervaardiging van ander isolate van witvrotfungi.
Afrikaans: Talle pogings is reeds aangewend om ensieme vir die afbreking van lignien in papierpulp te gebruik. Een ensiem wat bekend is vir die belangrike rol wat dit in die afbreking van lignien speel, is lakkase (EC 1.10.3.2; benseendiol:suurstof oksidoreduktase). Lakkase kan moontlik aangewend word in biobleikprosesse deur middel van die lakkase-mediatorstelsel. Witvrotfungi is welbekende produseerders van lakkase, maar daar is min bekend oor die kweking van hierdie fungi in vloeistofkultuur. Dit is, daarom, noodsaaklik om die uitwerking van verskillende parameters op lakkase en biomassaproduksie deur hierdie fungi vas te stel, wanneer hulle in vloeistofkultuur gekweek word. Die doel van hierdie studie was eerstens om fungus isolate te kies wat in staat is om hoë konsentrasie van hittestabiele lakkase te produseer en tweedens om die toestande vir die vervaardiging van lakkase te optimaliseer. Derdens was die doel om die kinetika vir die groei van en lakkasevervaardiging deur Pycnoporus sanguineus (L.:Fr.) Murr. (SCC 108) vas te stel. Die vermoë van die meeste fungi in ons kultuurversameling om lignienafbrekende ensieme te vervaardig, is voorheen bepaal. Hierdie resultate was egter kwalitatief en die aktiwiteit en hoeveelheid lakkases wat deur hierdie fungi vervaardig is, moes bepaal word. Isolate wat lakkase vervaardig sowel as verwysingsisolate en negatiewe kontroles is by die kwantitatiewe siftingseksperimente ingesluit om hiperproduserende isolate te identifiseer. Ensiemaktiwiteit is spektrofotometries bepaal deur van 2,2’ –azinobis (3- etielbenstiazolien-6-sulfonaat) as substraat gebruik te maak. Sestien isolate en ‘n verwysingsisolaat, Coriolus versicolor (Wulf.:Fr.) Quél. (ATCC 20869) is gekies om die hittestabiliteit en optimale temperature van die lakkase verder te evalueer. Sommige van die lakkases in die rou ekstrak het stabiliteit by temperature so hoog soos 65 °C vertoon. By 75 °C het die lakkase van P. sanguineus (SCC 108), P. sanguineus (SCC 207) en die ongeidentifiseerde isolaat (SCC 260) half-leeftye van meer as 30 min. vertoon. Molasse was ‘n geskikte medium vir die kweking van P. sanguineus en die vervaardiging van lakkase aangesien ‘n hoë vlak van lakkase-aktiwiteit en biomassa in skudflesse verkry is met 4 % molasse, selfs sonder enige voorafbehandeling. Molasse het bestandele bevat wat verhoogde lakkasevervaardiging tot gevolg gehad het indien dit met minerale soutmedia met gelykstaande hoeveelhede voedingstowwe vergelyk word. Molasse kon as ‘n lae koste koolstofvoedingsbron vir die kweek van P. sanguineus beskou word, maar daar was ‘n tekort aan sommige aanvullings vir optimale lakkasevervaardiging. Verhoogde lakkase-aktiwiteit is verkry deur die insluiting van sekere xenobiotiese bestanddele in beide die molasse en ‘n mineralesout medium. Hoë koolstof- tot stikstofverhoudings het die produksie van lakkase verhoog. Toe die fungus in ‘n 15-l bioreaktor gekweek is, is die stasionêre groeifase daarvan na meer as 60 h se kweking bereik. Lakkase-aktiwiteit het na 48 h vermeerder, wat aandui dat lakkasevervaardiging in die eksponensiële groeifase begin het en in die stasionêre fase voortgegaan het. Die kweking van P. sanguineus in ‘n mineralesout medium met 16 mM veratriel alkohol sonder pH-beheer en ‘n opgeloste suurstofspanning van 40 %, het die hoogste lakkasevervaardiging (8,13 Eenhede.ml-1) tot gevolg gehad. Daar is aanduidings dat lae pH vlakke lakkase produksie aktiveer. Hierdie studie van die kweking van P. sanguineus het bygedra tot ons kennis van die fisiologie en lakkasevervaardiging deur witvrotfungi. Hierdie resultate sou in industriële prosesse vir die vervaardiging van lakkase toegepas kon word en mag ook van toepassing wees by die lakkasevervaardiging van ander isolate van witvrotfungi.
Description
Keywords
Dissertation (M.Sc. (Microbial, Biochemical and Food Biotechnology)--University of the Free State, 2002, Laccase, Oxidation, Wood-decaying fungi, White-rot fungi, Batch cultivation, Inducers, Pycnoporus sanguineus, Biomass, Enzyme, Phenoloxidase